研究背景
胰腺导管腺癌(PDAC)是一种外分泌肿瘤，是胰腺癌中最常见的病理类型。虽然许多因素有助于正常胰管向侵入性前体病变转变为侵袭性PDAC，这一进展主要还是由炎症肿瘤微环境中固有的Kras突变驱动的。了解胰腺肿瘤微环境的成分和功能可能有助于开发新的诊断和更好的治疗方法。前言
铁死亡是一种通过铁介导的氧化损伤的一种细胞死亡方式。在本实验中，作者评估了铁与GPX4（一种重要的铁死亡抑制因子）耗竭在Cerulean或L-精氨酸诱导的胰腺炎小鼠胰腺和自发性胰管腺癌(PDAC)致癌的Kras小鼠模型中产生的影响。结果发现，无论是铁还是GPX4耗竭都能促使8-OHG的释放，从而激活TMEM/STING依赖的DNA传感器通路。因此，硫氧磷-1（铁死亡抑制剂)的使用、clophosome介导的巨噬细胞耗竭、或是药物和遗传抑制8-OHG-TMEM通路均能抑制Kras驱动的小鼠胰腺肿瘤发生。同时，研究发现，GPX4也是PDAC患者的预后指标。实验内容
一、高铁饮食或Gpx4耗竭促进实验性胰腺炎
因为胰腺炎是胰腺癌发展的既定危险因素，作者首先研究了铁死亡对Cerulean和L-精氨酸分别诱导的急性胰腺炎两种实验模型的影响。
在高铁饮食3个月后，小鼠的胰铁(.2±51.05μg/g)比对照饮食小鼠(59.62±4.04μg/g)多。与对照组相比，高铁饮食的小鼠更容易受到cerulean或L-精氨酸诱导的胰腺炎影响，死亡率显著提高。胰腺损伤的组织学评估显示高铁饮食组腺泡细胞死亡、白细胞浸润和间质水肿。而血清淀粉酶、胰腺胰蛋白酶和胰腺髓过氧化物酶的活性，高铁饮食组明显升高，表明高铁水平加速胰腺炎的发生过程。
接下来，我们确定了GPX4介导的抗氧化反应对实验性胰腺炎的影响。小鼠胰腺中Gpx4的条件KO不影响胰腺发育、内分泌功能和铁的水平，但导致cerulean或L-精氨酸诱导的胰腺炎比野生型(WT)小鼠发展得更快，死亡率、胰腺损伤和胰腺炎相关酶（包括淀粉酶、胰蛋白酶和髓过氧化物酶）明显增加。相反，liproxstatin-1，一种广泛使用的铁死亡抑制剂，通过其强大的抗氧化活性，保护免受cerulean或L-精氨酸诱导的胰腺炎，特别是在高铁饮食或Gpx4耗竭的情况下。
二、高铁饮食或Gpx4耗竭促进Kras驱动的胰腺肿瘤发生
与KC小鼠相比，Gpx4耗竭或高铁饮食进一步增加Kras介导的动物死亡以及胰腺重量增加，胰腺上皮内瘤变(PANIN)的形成和基质反应，相反，正常的腺泡细胞通过Gpx4耗竭或高铁饮食而减少。如预期，KC小鼠胰腺铁(.8±46.5μg/g)高于对照饮食(.7±30.12μg/g)。在正常饮食中，KC和KCG小鼠的胰铁无差异。在10~12个月的KCG小鼠中，肿瘤浸润或转移增加(KCG组为50%[5/10]，KC组为20%[2/10)。
三、巨噬细胞耗竭可减少胰腺肿瘤的发生
鉴于巨噬细胞是胰腺肿瘤早期发生的主要参与者，接下来，实验测试了Gpx4耗竭或高铁饮食对肿瘤微环境中巨噬细胞浸润和激活的影响。用F4/80免疫荧光染色观察巨噬细胞浸润情况，可以发现，肿瘤相关巨噬细胞(TAMS)在Kras驱动的小鼠（Gpx4耗竭或高铁饮食）中增加，表明铁和GPX4是胰腺肿瘤微环境中巨噬细胞浸润的调节因子。巨噬细胞可能极化成M1或M2样巨噬细胞。M1巨噬细胞主要存在于肿瘤开始并开始发展的慢性炎症部位。而在癌症进展过程中，巨噬细胞转变为M2样表型以表达IMMU抑制信号。从Gpx4耗竭或高铁饮食组中分离出的TAMs对在3个月内的M1样(如肿瘤坏死因子[Tnf]和交错基因)和在6个月M2样(例如，一氧化氮合酶2[Nos2/INos]和精氨酸酶-1[Arg1])具有较高的mRNA表达。使用liproxstatin-1可减少巨噬细胞在肿瘤细胞中的浸润和M1、M2在TAM中标记的mRNA表达，表明氧化损伤可能促进TAM的浸润和激活。正如预期的那样，YM1(M2标记物)在小鼠中的表达增加，在KCG和高铁饮食小鼠的肿瘤微环境中，liproxstatin-1降低。
为了进一步确定巨噬细胞在高铁饮食或Gpx4耗竭依赖的肿瘤发生中的作用，我们使用clophosome(clodronate脂质体)来耗尽巨噬细胞。与对照脂质体相比，克隆体对巨噬细胞的药理抑制减少了Kras驱动的Gpx4耗竭(KCG)或高铁饮食的小鼠的死亡，以及胰腺的重量、PanIN的生成和基质反应。因此，克隆体下调了Sox9、Krt19、Vim和MMP9的mRNA表达，由此得出，因此，大量的巨噬细胞积累似乎是依赖高铁饮食或Gpx4耗竭的胰腺肿瘤发生所必需的因素。四、氧化核酸酶通过TMEM诱导巨噬细胞迁移和活化
损伤相关分子模式(DAMPs)是由死亡或死亡细胞释放的内源性分子，有助于调节肿瘤微环境中的免疫反应。Gpx4耗尽或高铁饮食均会导致在胰腺或血清中氧化的DAMPs产生和释放增加，包括4-羟基烯醛和8-羟基-2‘-脱氧鸟苷。使用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)分析观察到胰腺DNA中8-OHG的水平为在Gpx4耗竭或高铁饮食下增加，相反，liproxstatin-1(但不是clophosome)减少了因Gpx4耗竭-或高铁饮食的小鼠的胰腺或血清中4-HNE和8-OHG的产生。
接下来，实验测试了这些氧化损伤相关的DAMPs是否能在体外调节巨噬细胞的迁移和激活。与4-HNE相比，8-OHG(ng/ml)显著诱导在原代小鼠骨髓(BMDMs)或人血单核细胞(HPBMs)中的细胞迁移(Fig.4c)和细胞因子(如g.、Il6和Nos2)的表达或释放。对照鸟苷(ng/ml)不能诱导巨噬细胞的细胞迁移和细胞因子表达/释放，而生理浓度(5ng/ml23)的8-OHG不能诱导BMDM中IL-6的释放，这些结果支持了氧化核酸酶(例如8-OHG)而不是氧化脂质的想法，可能促进巨噬细胞在病理浓度下的迁移和激活。鉴于8-OHG是一种氧化DNA损伤产物，实验接着测试了TMEM是否是宿主细胞中主要的DNA传感调节因子，调节8-OHG活性。DNA传感器环GMP-AMP合成酶(CGAS)与宿主DNA结合，启动TMEM依赖的反应。与对照KC小鼠相比，KCG小鼠肿瘤中8-OHGDNA和CGAS的共定位增加，支持先前发现的8-OHG是CGAS的直接配体。在Kras驱动的PDAC小鼠中，TMEM或CGAS在肿瘤微环境中的表达以时间依赖性的方式增加。在体外，Tmem的耗竭阻断了8-OHG诱导的细胞迁移和在BMDM中IL6和Nos2的mRNA表达。相比之下，CPGDNA受体Toll样受体9(TLR9)的耗竭在8-OHG诱导的细胞迁移和BMDM中细胞因子没有变化。总之，TMEM而非TLR9，是8-OHG诱导的巨噬细胞迁移和激活所必需的因素。五、TMEM促进胰腺肿瘤的发生
为了确定TMEM通路是否是胰腺肿瘤发生所必需的，我们首先给Kras驱动的Gpx4耗竭的小鼠注射抗-8-OHG抗体，与对照免疫球蛋白G(IgG)相比，抗-8-OHG抗体延长了小鼠的存活时间并抑制Gpx4耗竭介导的胰腺增重，快速肿瘤进展，减少PanIN的形成。减少基质反应和TAM浸润。
同样，Tmem(Tmem?/?)的耗竭也保护了因Gpx4耗竭引起的小鼠死亡和肿瘤进展，以及Kras驱动小鼠TAM浸润的减少。阻断8-OHG-TMEM通路亦可以减少Gpx4耗竭引起的胰腺Sox9、Krt19、Vim和MMP9的上调。过多的8-OHG积累可能促进染色体不稳定，如端粒异常。但与对照KCG小鼠相比，端粒荧光原位杂交(FISH)分析表明，KCGT小鼠Tmem的耗竭并没有显著改变端粒缺乏这个问题。有趣的是，通过克隆体的巨噬细胞耗竭降低了KCG和高铁饮食小鼠TMEM表达的增加，这一结果表明巨噬细胞浸润和TMEM激活与铁死亡诱导之间存在反馈机制。综上可知，8-OHG-TMEM通路的激活以与端粒损伤无关的方式促进胰腺肿瘤的发生。六、GPX4是人类PDAC的预后指标
通过动物研究表明，GPX4可能起抑癌作用，而TMEM可能在胰腺肿瘤中起致癌作用。实验采用TCGA分析上述猜想，与正常组相比，PDAC肿瘤组的GPX4和TMEM的mRNA表达均上调。在PDAC患者中，KRAS和TMEM的mRNA表达也呈正相关。相比之下，患者的KRAS和GPX4的mRNA表达无显著相关性。虽然巨噬细胞耗竭降低了小鼠肿瘤微环境中TMEM的表达，PDAC患者GPX4和TMEM的mRNA表达与巨噬细胞标志物CD之间无显著相关性。
整体生存试验进一步表明，GPX4的高表达与PDAC患者的生存时间增加有关。而TMEM的mRNA表达与PDAC患者的整体生存率之间没有显著的相关性，此外，GPX4的低表达结合TMEM的高表达增加了PDAC患者的死亡率。上述结果表明，GPX4可能是人类PDAC的预后指标。总结在本研究中，我们发现了一种不同的机制，其中铁死亡损伤可能通过激活TMEM依赖的DNA传感途径促进Kras驱动的PDAC。而这些发现也说明了在研究不同含量的肿瘤微环境时，需要仔细考虑组织损伤和细胞死亡的免疫学特征。
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