撰文：mumu
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亮点
组织损伤相关的胰腺炎与Kras癌基因的激活突变组合作用，显著加快早期肿瘤病变的形成，并最终引发腺癌。
在胰腺前上皮细胞组织损伤后最迅速激活的因子中有白细胞介素33，它再现了损伤与突变的Kras合作的效果，以释放早期肿瘤和肿瘤转化的表观遗传重塑程序。
年2月3日，SloanKettering癌症中心的ScottW.Lowe博士在《Nature》上发表了一篇名为“Agene–environment-inducedepigeneticprograminitiatestumorigenesis”的文章。文中报道在胰腺癌小鼠模型中，组织损伤相关的胰腺炎与Kras癌基因的突变协同作用，显著加速早期肿瘤的发生，最终导致恶性腺癌。该研究通过整合基因组学和单细胞染色质检测，以及在原位小鼠模型中的特定功能位点进行干预控制，发现Kras的突变和组织损伤组合促进了胰腺上皮中独特的染色质状态，该状态将正常细胞向致瘤性转化。这种与癌症相关的表观遗传状态在胰腺损伤后48小时内出现，并涉及一种“腺泡到瘤化”的染色质转换，这种转换引起人类胰腺癌基因的早期失调。在癌前胰腺上皮组织损伤后，活化最迅速的因子之一是警报蛋白细胞因子白介素33，它概括了与Kras突变协同的损伤作用。环境损伤与Kras基因突变协同释放早期肿瘤形成和转化的表观遗传重塑程序。总的来说，该研究证明了基因与环境的相互作用如何通过迅速产生基因调控程序来启动早期肿瘤发生，并提供了一个分子框架，用来理解癌症发生过程中遗传和环境因素之间的相互作用。
组织损伤会促进癌症发生，若了解相应机制，将有助于制定合理的策略，在肿瘤发展到难以解决的阶段之前对其进行预防、检测和阻断。组织损伤致癌的其中一个例子是胰腺导管腺癌（PDAC），这种癌症总是致命的，而且缺乏有效的治疗手段。它的主要癌基因突变KRAS几乎在所有PDAC患者中都发生过，似乎是肿瘤发生过程所必经的事件。突变KRAS本身具有弱致癌性，但可能与组织损伤和由此引起的炎症（胰腺炎）诱导的信号协同作用，从而在小鼠体内引发疾病。正常情况下，胰腺损伤会触发细胞的快速转变，其特征是腺泡分化丧失和“导管样”状态形成，这一过程称为腺泡导管化（ADM），将通过腺泡再分化得以恢复。然而，若存在Kras突变，组织损伤则导致ADM异常持续，并转变为胰腺上皮内瘤变（PanIN）。这些结果表明，致癌KRAS选择其他修复性再生反应协同驱动PDAC的启动。鉴于在突变Kras且明显缺乏额外突变的情况下，组织损伤后迅速出现肿瘤病变，研究人员假设未表征的表观遗传机制背后癌症的倾向性突变和癌症发病的环境损害之间存在相互作用。
作为研究基因-环境相互作用如何在肿瘤发展过程中重新编程胰腺上皮的第一步，研究者利用基因工程小鼠模型（GEMMs）生成了从健康、受损、早期肿瘤或恶性组织中分离的胰腺上皮细胞的染色质可及性图谱，用荧光报告基因mKate2选择性标记胰腺外分泌上皮细胞。具体而言，来自以下组织条件的mKate2+细胞接受ATAC-seq（通过测序检测转座酶可及染色质）：（i）正常健康胰腺（‘正常’）；（ii）正常胰腺经历组织损伤驱动的再生ADM（‘损伤’）；（iii）Kras突变胰腺经历随机肿瘤转化（Kras*）；（iv）Kras突变体胰腺经历组织损伤加速的同步肿瘤重编程（Kras*+损伤）；（v）KPflC小鼠（Ptf1a-cre；RIK；LSL-KrasG12D；p53fl/+）或KrasG12D同种原位移植后产生的PDAC（PDAC），作为晚期疾病的参考（图1a）。每种情况下，差异可及性分析用于识别与正常情况相比显著增加或减少的开放染色质区域（峰值），分别称之为“ATAC增加”和“ATAC缺失”区域。如图1b所示，这些分析揭示了不同条件下染色质可及性的大规模变化，大多数变化是由组织损伤和突变Kras在肿瘤发生早期的协同作用引起的（PC1：56%），而不是从早期肿瘤形成到PDAC的后期转变（PC2:16%）。值得注意的是，组织损伤和致癌Kras的联合作用进行同步肿瘤重编程后，有一半以上细胞表现出染色质畸变，可以此区分晚期PDAC与正常健康胰腺（图1c），表明PDAC从一开始就选择染色质调节机制。
与伴随生理再生（损伤）的可逆化生相关的动态峰值，发生在持久、肿瘤前化生（Kras*或Kras*+损伤）中的动态峰值的比较显示出共同和独特的特征。ATAC缺失的变化在很大程度上是共同的，并且与腺泡分化的减少相一致，后者定义了两个过程优先受影响的位点，这些位点与腺泡细胞的特殊功能相关（图1d）。尽管ATAC增加区之间也存在重叠，但突变Kras和损伤的结合产生了大量额外的染色质（超过）可及性变化，这些变化在表达突变Kras的胰腺上皮细胞中未被观察到或仅受到损伤（图1d，e（蓝框））。对突变Kras和/或组织损伤敏感的所有动态峰的无监督层次聚类确定了特定于正常健康（A）、再生（R）和早期肿瘤（N）组织状态的开放染色质区域簇，以及共享（S）簇，以及同时出现两种刺激（N2）时唯一获得的大量峰。在晚期PDAC中，通过突变Kras和损伤（簇N2）的联合作用进行同步肿瘤转化的细胞所特有的ATAC增加的67%被保留，而单独针对每种损伤的簇（例如簇R）没有（图1e）。这些早期癌症相关的染色质结构在组织损伤后48小时内出现，并且与链接到PDAC相关途径，包括许多与癌症相关的因素。区分正常组织（A）、再生组织（R）和早期肿瘤组织（N）的大多数开放染色质区域映射到非编码基因间和内含子区域，这些区域包含控制胰腺细胞谱系定型的主转录因子（TF）的结合位点（例如，NR5A2和PTF1A）和致癌（例如，AP-1，SOX和KLF家族成员），TF基序富集和共现模式在不同条件下有所不同。
研究人员为了功能性地将染色质的变化与体内细胞命运的变化联系起来，接下来调整了上述小鼠模型，利用一种特征明确的染色质阅读器，即溴化域和额外末端（BET）家族成员BRD4，它结合乙酰化（活性）染色质，对增强子介导的细胞识别基因转录特别重要。据推断，在经历肿瘤或再生细胞命运转变的细胞中，BRD4功能的诱导靶向将以TF和不可知的方式干扰和暴露转录活性基因程序，这些程序定义了它们的状态并揭示了体内染色质状态和表型输出之间的功能联系。此外，这种遗传方法克服了药物BET抑制的混杂效应，它会同时破坏周围基质细胞的表观遗传程序。为了比较促肿瘤和再生程序，制作了不同Kras突变状态的模型，并包含靶向Brd4（两个独立菌株）或Renilla荧光素酶（对照组）的有效shRNA（图2a）。强力霉素处理的表达Brd4shRNA（shBrd4）的KCsh（表达Kras突变的shRNA）和Csh（表达Kras野生型的shRNA）小鼠-而不是RenillashRNA（shRen）对照组-BRD4蛋白的有效抑制（图2b），该蛋白仅限于mKate2和GFP双阳性（mKate2+GFP+）细胞。此外，从分类的mKate2+GFP+细胞获得的RNA测序（RNA-seq）和ATAC-seq数据表明，抑制BRD4导致预期抑制已建立的增强子相关细胞特性基因，而不降低这些位点的染色质可及性或整体影响转录（图2c）。
研究人员分析了选择性抑制BRD4在经历以上概述的再生和促肿瘤细胞命运转变的细胞中的表型后果。在再生和肿瘤环境中，BRD4抑制的细胞有效地失去其腺泡形态和腺泡标记物（CPA1和淀粉酶）的表达，同时获得导管（SOX9和KRT19）和去分化（簇蛋白）标记物，以响应组织损伤、突变Kras或其组合（图3a）。因此，尽管在受损组织中检测到明显的染色质变化（图1），但ADM并不需要BRD4功能，事实上，它抑制了这种细胞命运的转变。相比之下，在突变体Kras的情况下，抑制BRD4会损害ADM的正常再生以及向肿瘤的发展。在再生环境中，BRD4抑制的细胞在对照组化生消失时保留了化生特征（图3a）。在肿瘤方面，BRD4的抑制阻止了PanIN病变的出现（图3c，d）。在这两种情况下，选择表达shBrd4的化生细胞导致组织萎缩（图3a-c）。BRD4的上皮特异性抑制既没有降低MYC蛋白的水平，也没有重现MYC抑制的效果。这些结果揭示了对上皮化生和分化的不同表观遗传学要求，并将BRD4功能与上皮细胞可塑性的再生和肿瘤结果所需的MYC独立基因表达程序联系起来。为了确定这些程序，将图1中的染色质可及性景观与在存在和不存在BRD4的情况下触发经历促肿瘤或再生命运转变的胰腺上皮细胞（mKate2+GFP+）的RNA-seq和ATAC-seq图谱进行比较。与再生过程中观察到的与促肿瘤化生相比的不同染色质状态一致，每种情况下的BRD4敏感基因表达程序也不同（图3f）。在再生环境中（Csh：损伤），BRD4抑制减弱了与通过ATAC-seq鉴定的腺泡特异性（A）簇相关的基因表达（图3f）。在肿瘤环境（KCsh:Kras*+损伤）中，BRD4的抑制也侵蚀腺泡基因表达，但除此之还削弱了更多基因的激活，这些基因原本可以选择性地获得并且在这种情况下被诱导（簇N1和N2）（图3f）。这些肿瘤特异性BRD4靶点包括致癌KRAS的效应子、癌症相关转录网络的靶点和具有晚期人类PDAC特征的基因。与对染色质转录输出的直接影响一致，BRD4的扰动并不能阻止在对照组中观察到的损伤驱动染色质状态的获得。这些结果在功能上将正常细胞和Kras突变细胞的不同损伤诱导的染色质状态与再生或肿瘤转化所需的不同BRD4依赖性转录程序联系起来。
为了揭示突变KRAS通过其将再生性损伤反应重定向到肿瘤的潜在机制，对上述上皮状态的全谱进行了RNA-seq分析（图1a）。转录、染色质可及性和shBrd4敏感性分析的整合确定了两类主要的差异表达基因（DEG），它们区分来自正常健康组织（正常）、再生（损伤）和早期肿瘤（Kras*、Kras*+损伤）的胰腺上皮（mKate2+）细胞和癌组织（PDAC）：在所有条件下具有普遍开放的调控元件的DEG（染色质稳定的DEG）和在一个或多个相关调控元件（染色质动态DEG）处表现出平行ATAC增加或缺失的DEG（图4a）。
与正常健康组织（正常）相比，在再生（损伤）、早期肿瘤（Kras*、Kras*+损伤）和癌组织（PDAC）中改变的DEGs的动态顺式调节元件的TF基序分析揭示了转录活性开放染色质的共同再分配，从含有指定TFs的腺泡谱系结合位点的位点（图4b，蓝色或绿色峰）到富含伤口愈合或癌症相关转录因子基序的新可到达区域，包括AP-1转录因子家族（图4b，红色峰）。然而，这些基因座的无监督聚类确定了一个基因调控程序，该程序是由突变Kras和组织损伤的协同效应唯一诱导的（图4b）。因此，在不同条件下，甚至在相同TF家族的成员之间，预测结合差异活性染色质结构域的TF的相对表达也不同。与此肿瘤特异性表观遗传程序在癌变过程中的作用一致，Kras突变胰腺损伤后不久改变的基因调控活性和表达输出在很大程度上与晚期疾病患者共享（并进一步恶化），与定义人类PDAC（图4c）的特征密切相关，并且在不能进展为肿瘤的shBrd4化生细胞中减弱（图4d）。因此，尽管腺泡分化的丧失足以在生理化生过程中激活某些AP-1TF成员和其他癌症相关网络，但损伤驱动的染色质可及性变化促进的独特表观遗传程序对于肿瘤的发生是必需的。
为了确定这种肿瘤特异性染色质状态是否反映了真正的染色质重塑（相对于形成上皮细胞的先前存在的不同细胞类型比例的改变），对从Kras*或Kras*+损伤条件分离的多个Kras突变细胞进行了单细胞ATAC-seq（scATAC-seq）。这些分析揭示了通过特异性基因座的重塑与原先检测到的基因座一致，损伤导致的染色质可及性快速变化是由恶性前Kras突变细胞的表观遗传异质亚群内和跨损伤引起的（r=0.，0.）。组织损伤后Kras突变体细胞的TF活性发生变化（图4e），并且它们的活性分数在单细胞表观遗传图谱中呈反相关（图4f）。scATAC-seq分析还捕捉到具有特定染色质状态（例如腺泡状态）的细胞耗竭，与肿瘤相关位点处广泛染色质开放所定义的低分化亚群的出现相一致。相比之下，大多数上皮亚群（包括腺泡基因染色质开放的细胞）中发现化生相关基因以开放状态预先存在，并且与大量分析一致，损伤后未显示进一步的ATAC增加。因此，尽管目前通过相关观察推断了导致这种早期表观遗传异质性和损伤驱动可塑性的特异性TFs的活性，但这些结果表明致癌突变和组织损伤共同重塑染色质以产生肿瘤特异性转录程序。研究人员将这个过程称为“腺泡到肿瘤”染色质开关。
许多肿瘤特异性染色质激活基因编码膜结合和分泌蛋白（图4g、5a）。最强有力的激活因子是细胞因子白细胞介素33（IL-33），一种协调伤口愈合和组织修复反应的损伤相关因子。对大量和scATAC-seq染色质可及性数据集的分析一致地确定了Il33位点的许多峰值，这些峰值在经历损伤促进染色质转换（Kras*+损伤）的Kras突变胰腺中快速且选择性地获得，并保留在已建立的PDAC中。这些变化与胰腺上皮内Il33表达的BRD4依赖性增加相关（图5a，b）。对40种不同细胞因子的多重免疫分析确定IL-33是损伤后Kras突变胰腺中最丰富的细胞因子。接下来，用重组IL-33（rIL-33）治疗表达突变型（KC）或野生型（C）Kras的小鼠，研究外源性IL-33在多大程度上可以重现组织损伤的影响。值得注意的是，rIL-33在与突变KRAS协同激活肿瘤特异性BRD4依赖性基因表达程序时模拟了损伤的影响，该程序由恶性前胰腺组织损伤诱导（图5c，d），包括在人类晚期PDAC中上调的基因。在这些转录输出之前，癌前Kras突变组织中对损伤敏感的癌相关基因座上的ATAC获得和基因表达，并且与PanIN病变的加速出现相关（图5e，f）。值得注意的是，rIL-33对正常胰腺无明显影响（图5e，f）。这些结果表明IL-33是驱动早期肿瘤形成的基因-环境相互作用的靶点和效应器，并提示了一种染色质介导的扩增机制，即组织损伤介质释放和加强癌基因依赖性基因的表达。
受损组织中的大规模染色质可及性重构，在癌基因Kras突变的存在下，导致在生理再生过程中不可获得的表观遗传程序，该程序有助于肿瘤的发生，并在恶性进展过程中被选择。胰腺化生涉及腺泡特性位点的表观遗传沉默，这种沉默因BRD4抑制而加剧。相比之下，肿瘤的进展将去分化与一个独特的染色质重塑程序相结合，该程序将DNA可及性和BRD4介导的转录从正常谱系转移到癌症定义位点。因此，尽管增强子重构促进晚期PDAC的转移，这些数据暗示染色质失调是胰腺肿瘤发生的早期事件。遗传损伤和环境损伤之间的相互作用促进了癌症的发生。该研究确定了一种表观基因机制，这种机制与腺泡到肿瘤的染色质转换有关，这种染色质转换可在组织损伤后48小时内出现在癌前Kras突变的胰腺上皮细胞中。该程序的一个关键靶点是IL-33，其细胞因子活性可以代替损伤，以加速早期肿瘤（PanIN）病变的形成。尽管IL-33在晚期癌症中既能抑制又能增强抗肿瘤免疫，但在早期肿瘤形成过程中，将组织损伤反应与癌基因依赖性上皮可塑性联系起来。对这些和其他表观遗传失调程序的进一步研究可能为合理设计早期检测和治疗策略提供新的机会，从而在早期阻断炎症和RAS驱动的恶性肿瘤，如PDAC。
教授介绍
ScottW.Lowe博士是SKI癌症生物学与遗传学计划主席。他因对抑癌基因p53的研究而闻名，该基因在近一半的癌症中都发生了突变。其实验室主要研究控制细胞凋亡和衰老的肿瘤抑制网络，以及它们如何影响恶肿瘤发展。基于小鼠模型，RNA干扰（RNAi）和癌症基因组学来识别肿瘤抑制基因网络的组成部分，并了解治疗反应的分子决定因素。还使用时间可调节的RNAi技术来鉴定维持肿瘤所需的基因，并探索参与肿瘤消退的机制，包括细胞内在和外在机制。目标是获得对肿瘤抑制网络的更全面了解，并确定癌症维持基因，这些基因将成为与特定癌症基因型相关的有用治疗靶标。为已在国际知名期刊Nature、Cell及其子刊上发表了多篇文章。
参考文献
Alonso-Curbelo,D.,Ho,YJ.,Burdziak,C.etal.Agene–environment-inducedepigeneticprograminitiatestumorigenesis.Nature().