摘要：与体内正常组织相比，在癌症组织中已经观察到高水平的活性氧(ROS)，并且还不知道这如何影响化疗药物的作用。阳离子卟啉5，10，15，20-四-(N-甲基-4-吡啶基)卟啉(TMPyP4)是一种用于光动力疗法(PDT)的光敏剂和用于治疗端粒酶阳性癌症的端粒酶抑制剂。在这里，作者研究了在H2O2中培养的A和PANC细胞中TMPyP4的抗癌活性。结果表明，与单独的TMPyP4相比，TMPyP4和H2O2的组合对A和PANC细胞的细胞活力、集落形成抑制和凋亡具有敏化作用，但对人正常MIHA细胞没有影响。在机制上，TMPyP4和H2O2的组合激活A和PANC细胞中的高活性氧和线粒体膜电位，导致强烈的DNA损伤和DNA损伤反应。因此，与单独的TMPyP4相比，TMPyP4和H2O2联合处理上调A和PANC细胞中BAX、裂解的caspase3和p-JNK的表达，并下调Bcl-2的表达。综上所述，这些数据表明H2O2增强了TMPyP4介导的ROS依赖性DNA损伤和相关凋亡蛋白调节的抗癌活性，揭示了高ROS肿瘤微环境在化疗药物作用中起重要作用。
背景介绍：
肿瘤微环境(TME)的特点是活性氧(ROS)含量高，TME活性氧的升高主要是由于线粒体中超氧化物歧化酶的歧化作用。此外，活性氧的产生也归因于肿瘤细胞的快速增殖。众所周知，活性氧在肿瘤发生中起重要作用，并影响许多生物学过程，如炎症、基因组不稳定性、代谢重编程、抗凋亡和细胞增殖。此外，已发现活性氧与耐药性和抗肿瘤药物的功效密切相关。如上所述，活性氧在癌症发展和化疗疗效方面具有无可争议的重要性。因此，TME的高活性氧不仅可以作为选择性抗肿瘤治疗的策略，而且可以作为抗肿瘤药物选择性的优先考虑因素。
在所有卟啉衍生物中，TMPyP4被认为是一种有前途的光敏剂，因为它具有高水溶性、有限的暗毒性、高ROS产生率、高细胞膜渗透性和优先在肿瘤细胞中积累。近年来，已经发现TMPyP4也是一种G-四链体稳定剂，因此可以抑制端粒酶阳性癌细胞的端粒酶活性。因此，TMPyP4可能比其他抗肿瘤药物具有更大的临床应用前景，因为它同时具有光敏剂和端粒酶抑制活性。如上所述，尽管TME的高活性氧对抗肿瘤药物效率的影响不可忽视，且四甲基吡啶酚的临床应用潜力巨大，但TME的高活性氧对四甲基吡啶酚的影响仍不清楚。
结果：
本研究中，作者旨在研究TMPyP4在TME相关的高活性氧下的抗肿瘤活性，并探讨其在A细胞和PANC细胞中的潜在机制。
1.H2O2通过抑制细胞活力、抑制集落形成和增强细胞凋亡来增强TMPyP4对A和PANC细胞的抗癌活性
首先，作者检测了H2O2是否增强了TMPyP4的抗肿瘤作用，细胞活力测定表明，在0–50微米的浓度范围内，H2O2显著增加了TMPyP4对A和PANC细胞的细胞活力抑制作用，但对正常肝MIHA细胞没有影响。
此外，已经证实TME的H2O2浓度可能高达毫摩尔水平。因此，选择TMPyP4(10微米)和H2O2(微米)的最佳浓度用于以下实验。
结果显示，与单独的TMPyP4处理相比，TMPyP4和H2O2的组合对A和PANC细胞具有更强的细胞存活抑制作用，而对MIHA细胞没有叠加的细胞毒性。
此外，H2O2和TMPyP4的相互作用通过组合指数值得到验证。结果表明，H2O2与TMPyP4结合对肺癌A细胞和胰腺癌PANC细胞都表现出协同作用。集落形成试验表明，H2O2增强了TMPyP4对A和PANC细胞集落形成能力的抑制作用，但对MIHA细胞具有轻微的抑制作用。
此外，凋亡测定表明H2O2选择性地增加了TMPyP4诱导的凋亡A和PANC细胞的数量，但没有增加MIHA细胞的数量。
综上所述，这些结果揭示了H2O2通过抑制细胞活力、抑制集落形成和增强细胞凋亡来增强TMPyP4对A和PANC细胞的抗癌活性。
2.H2O2增加TMPyP4诱导的A和PANC细胞的活性氧生成
众所周知，作为光敏剂，TMPyP4能产生大量的ROS，高水平的ROS可导致细胞氧化应激，导致生物分子损伤和细胞凋亡。因此，在A和PANC细胞中，推测TMPyP4与H2O2结合可能比单独TMPyP4产生更多的活性氧是合理的。流式细胞术结果显示，过氧化氢可以增强经四甲基吡啶处理的A和PANC细胞系中活性氧的产生，而对MIHA细胞系没有影响。
这些结果与来自荧光分析的数据一致，其显示与单独的TMPyP4或H2O2处理的细胞相比，TMPyP4与H2O2处理的A和PANC细胞组合具有更高的细胞内ROS水平，但是它们在MIHA细胞中都具有与对照相同的ROS水平。
总的来说，这些数据表明H2O2通过提高A和PANC细胞内的ROS水平来增强TMPyP4的抗癌活性。
3.H2O2通过线粒体介导的途径增强TMPyP4诱导的细胞凋亡
一般认为，活性氧水平的增加是由于细胞内氧化还原状态紊乱，从而导致线粒体功能障碍。线粒体膜电位(δψm)的丧失对细胞有害，并导致细胞色素C释放到胞质溶胶中。用JC-1染料通过流式细胞术检测线粒体膜电位。数据显示，与单独的TMPyP4相比，TMPyP4与H2O2的组合显著降低A和PANC细胞的线粒体膜电位，但对MIHA细胞没有影响。
接下来，通过蛋白质印迹法测定线粒体介导的凋亡途径相关蛋白Bax和Bcl-2的表达。与单独的TMpy4或H2O2处理相比，TMpy4与H2O2处理结合显著增加A和PANC细胞中Bax/Bcl-2的比率，而对MIHA细胞没有影响
此外，荧光染色和蛋白质印迹分析的结果表明，与单独的TMPyP4或H2O2处理相比，TMPyP4结合H2O2处理增加了A和PANC细胞中裂解的胱天蛋白酶3的表达，但对MIHA细胞没有影响。
已经证实，线粒体依赖性细胞凋亡涉及由c-JunN末端激酶引起的BAX/Bcl-2蛋白的改变(JNK）。作者的结果显示，在A和PANC细胞中，与单剂治疗相比，TMPyP4联合H2O2治疗显著增加了p-JNK的表达，但对MIHA细胞的作用有限。
综上所述，目前的结果表明H2O2通过线粒体介导的途径增强TMPyP4诱导的细胞凋亡。
4.H2O2加重TMPyP4诱导的A和PANC细胞的DNA损伤和DNA损伤反应
以前有报道称，活性氧的增加和积累会导致脱氧核糖核酸的氧化损伤，包括单链断裂、双链断裂和其他损伤。采用碱性彗星试验和中性彗星试验检测TMPyP4、H2O2或TMPyP4联合H2O2对A和PANC细胞DNA损伤的影响。正如预期的那样，结果表明，与单一药物处理相比，TMPyP4和H2O2联合作用对A和PANC细胞的DNA损伤更严重，而H2O2对TMPyP4诱导的MIHA细胞DNA损伤无影响。
此外，IF分析表明，与TMPyP4或H2O2单独处理相比，TMPyP4与H2O2联合处理在A和PANC细胞中引起每个细胞更多的53BP1焦点，显示这些细胞中DSB的强烈积聚，引发强烈的DNA损伤反应，而H2O2对TMPyP4诱导的MIHA细胞系的DNA损伤反应没有影响。
这些结果与Westernblot分析数据一致，表明TMPyP4和H2O2联合处理组A和PANC细胞中γ-H2AX的表达明显高于TMPyP4或H2O2单独处理组但在MIHA细胞中的表达趋势则相反。
总之，这些数据表明，H2O2增强了TMPyP4诱导的A和PANC细胞系的DNA损伤和DNA损伤反应。
结论：
本研究提供的证据表明，H2O2增强了TMPyP4的抗癌活性，包括促进TMPyP4诱导的细胞活力和集落形成的减少，以及细胞凋亡。这一发现的意义在于，高细胞内ROS水平是TME的典型特征。已发现细胞内ROS水平失衡对细胞有害，导致强烈的DNA损伤导致细胞凋亡。正因为如此，ROS一直被认为是TME有价值的治疗靶点。作者的结果显示，当使用敏感的自由基指示剂DCFH-DA探针时，TMPyP4与H2O2联合处理的A和PANC细胞内ROS水平明显高于TMPyP4或H2O2单独处理的组。由于细胞内ROS主要由线粒体产生，有人认为H2O2通过ROS介导的线粒体依赖途径增强TMPyP4的抗癌活性。JC-1绿色荧光的升高表明，与TMPyP4或H2O2单独处理组相比，TMPyP4联合H2O2处理的A细胞和PANC细胞线粒体膜电位降低。线粒体功能紊乱影响凋亡相关蛋白的调节和表达。因此，本研究中的数据表明，TMPyP4联合H2O2处理的A细胞和PANC细胞中，促凋亡蛋白Bax的表达上调，抗凋亡蛋白Bcl-2的表达下调，导致Bax/Bcl-2的比值增加。此外，TMPyP4和H2O2处理的A细胞和PANC细胞中切割的caspase3和磷酸化JNK(p-JNK)的活性增加，进一步表明H2O2促进的凋亡是一种ROS介导的线粒体依赖的途径。细胞内ROS失衡会引发强烈的DNA损伤和DNA损伤反应。作者的结果表明，H2O2增强了TMPyP4诱导的DNA损伤，并引发了更强的DNA损伤反应。综上所述，本研究结果提示，H2O2通过破坏ROS介导的线粒体功能，上调凋亡相关蛋白，引发强烈的DNA损伤，激发强烈的DNA损伤反应，从而增强TMPyP4的抗癌活性。在正常人肝细胞MIHA细胞中没有观察到这种作用，表明TMPyP4在癌症治疗中的优势。
综上所述，这些数据表明H2O2增强了TMPyP4介导的ROS依赖的线粒体功能障碍的抗癌活性，导致凋亡相关蛋白表达上调，从而引发DNA损伤。
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