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临床批准的药物共组装形成超分子纳米纤维用于肿瘤光热免疫治疗
大家好，今天给大家推荐的文章是4月发表在Adv.Mater.上的论文，通讯作者是中国科学院过程工程研究所的闫学海研究员。
胰腺癌是一种极其致命的恶性肿瘤，中位生存期为6个月，5年生存率仅为1%。这种疾病难以治疗的原因与以下两个因素有关：一方面，胰腺致密的纤维增生间质(组织学上约占肿瘤的90%)使得临床对传统的治疗方案产生了耐药性。导致这种耐药性的因素包括缺氧和血管基质的屏障，这阻止了全身注射放疗或化疗药物进入肿瘤组织，对正常组织的严重副作用也是不可避免的。此外，只有15%的胰腺肿瘤采用手术治疗。另一方面，胰腺肿瘤细胞有通过血液和淋巴结转移的倾向，损害其他器官的功能。因此，开发一种有效的治疗模式来抑制胰腺肿瘤生长，同时消除肿瘤转移和最小化全身副作用仍然具有挑战性。
肿瘤近红外(NIR)光热免疫治疗是快速热消融和适度免疫调节相结合的互补疗法，在胰腺肿瘤的治疗中具有独特的优势。首先，这些药剂在-nm波长的刺激下进行近红外光热转换，能够实现深度渗透且副作用最小理想情况下，热疗会对富含光热剂的肿瘤组织造成不可逆的损伤此外，局部注射给药策略克服了与胰腺肿瘤相关的间质障碍，使药物精确、均匀地分布到肿瘤部位，并具有可持续的用药剂量。基于此，中国科学院过程工程研究所的闫学海研究员团队利用共组装免疫调节胸腺嘧啶(TP5)和吲哚青绿(ICG)形成的纳米纤维(TP5-ICGNFs)用于胰腺肿瘤的局部近红外免疫治疗。值得注意的是，TP5几十年来一直应用于小鼠临床的免疫调节，同时保留了原始的荧光成像和光热转换功能。此外，较高长宽比的纳米纤维结构在肿瘤组织中的滞留比其他纳米结构(如纳米球)更明显，这些纳米结构更有利于局部注射。值得注意的是，所制备的TP5-ICGNFs在光降解、胶体分散和生理条件下表现出较好的稳定性，使其适合于具有可靠的药物剂量和最佳治疗窗口的局部注射。这种具有许多有益特征的TP5-ICGNFs对胰腺肿瘤的疗效是很有前景的。作者的研究结果表明，肿瘤组织的快速光热治疗和全身适度的免疫调节相结合，可以有效的抑制肿瘤生长，消除肿瘤转移，将一次注射和一次照射后的全身副作用降到最低(图1)。特别是临床批准的用于形成超分子纳米药物的成分，为胰腺癌的临床治疗提供了一个有效的治疗模式。
图1基于胸腺五肽的近红外光热免疫调节纳米纤维的制备和应用示意图。a)胸腺肽(TP5)和吲哚菁绿(ICG)的化学结构；b)氢键驱动TP5和ICG共组装形成纳米纤维，蓝色虚线表示氢键；c)TP5-ICG纳米纤维对胰腺癌生长和转移的光热和免疫调节作用。
TP5(Arg-Lys-Asp-Val-Tyr,RKDVY)是源于胸腺生成素(32-36号残基)的序列，具有类似于胸腺生成素促进胸腺细胞分化和调节成熟T细胞的免疫调节生物活性，目前已被广泛应用于临床。此外，TP5具有五肽结构，它包含多个氢键位点。具有自组装能力的ICG是一种用于临床的近红外造影剂，它具有较高的生物相容性和良好的生物代谢能力。因此，作者选择TP5用于调节ICG的自组装，TP5和ICG通过非共价相互作用很容易得到胶体溶液。TP5分子的93.4%和ICG分子的94.7%参与了NFs的形成，它们的质量比为7.9:1.0，接近于投料质量比8.0:1.0。透射电镜(TEM)图像(图2a)和原子力显微镜(AFM)图像(图2b)显示，TP5和ICG共组装形成了平均直径约等于25nm的NFs。与自由分散的ICG(在水溶液中)的吸收光谱相比，TP5-ICGNFs的肩峰(~nm和~nm)发生了红移(图2c)，表明形成了纳米粒子。由于光穿透深度与波长正相关，因此红移，特别是超过nm的波长，对肿瘤治疗是有益的。有趣的是，与游离ICG相比，TP5-ICGNFs在约nm处的荧光发射强度增强(图2d)。ICG具有化学和构象不稳定的烯烃结构荧光强度的增强表明，TP5-ICGNFs之间的氢键作用使得ICG分子在长程有序的NFs中均匀分布，这意味着由于邻近TP5分子的空间位阻，较短的分子间距离限制了ICG分子内的烯烃运动，抑制了它们不规则的自聚集，从而增强了荧光强度。。为了进一步阐明氢键在纳米纤维结构形成中的作用，进行了傅里叶变换红外光谱(FTIR)分析。在TP5-ICGNFs中，ICG的S=O键的拉伸振动从cm-1移动到cm-1，ICG的O=S=O对称拉伸振动从cm-1移动到cm-1。TP5在cm-1处的C=O拉伸振动位移为cm-1，在cm-1处的N-H拉伸振动位移为cm-1。这些特征谱带的转移表明ICG的磺酸基与TP5的酰胺基之间形成了氢键S-O…H-N(图2e)。此外，全原子分子动力学模拟验证了TP5-ICGNFs中涉及的分子间氢键(图2f)，这与FTIR光谱结果一致。高纵横比的纳米结构增加了由于肿瘤部位缓慢的血流而产生滞留效应的可能性。
图2TP5-ICGNFs的表征。a)TP5-ICGNFs的TEM图像。插图显示了TP5-ICGNFs水溶液的光学图片；b)TP5-ICGNFs的AFM图片；c)ICG浓度为0.05mgmL-1时，游离ICG和TP5-ICGNFs的紫外-可见吸收光谱和荧光发射光谱；e)ICG、TP5和TP5-ICGNFs的FTIR光谱；f)典型分子簇，表明TP5-ICGNFs中涉及的分子间氢键相互作用，蓝色虚线表示氢键。ICG和TP5分子中的碳原子分别用绿色和银色标记，氮原子用红色标记，氧原子用黄色标记，硫原子用紫色标记。
如图3所示，在TP5-ICGNFs实验组，细胞坏死或凋亡(图3a和3c)，表明TP5-ICGNFs有效的光热细胞毒性。相比之下，PBS孵育的细胞仍然存活(图3b和3d)，说明激光照射的生物相容性。此外，使用标准的3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5二苯基四唑溴化铵(MTT)测定定量研究细胞活力(图3e和3f)。结果显示，TP5-ICGNFs联合nm激光照射(0.6Wcm-2)1分钟可抑制细胞活力，特别是在高浓度TP5-ICGNFs作用下。此外，TP5-ICGNFs暗箱孵育对细胞活力无影响，表明TP5-ICGNFs具有优越的生物相容性，没有固有毒性。作者进一步评价了体外免疫调节作用。树突状细胞(dc)是激活T细胞最常见的抗原细胞。共刺激分子CD80和CD86的表达是树突状细胞成熟的标志，这对适应性抗肿瘤免疫治疗具有重要意义。未经激光照射的不同配方处理小鼠dc(DC2.4)后，TP5-ICGNFs组CD80和CD86表达水平分别增加了至少1.7倍和1.6倍，这与TP5的免疫调节作用有关(图3g)。光疗可诱导肿瘤细胞的免疫死亡，辅助树突状细胞成熟。因此，在激光照射下，TP5-ICGNFs组CD80和CD86的表达均进一步增加，至少增加了2.4倍(图3h)。此外，流式细胞实验还分析了不同处理下树突状细胞的成熟率(CD11c+CD80+CD86+)(图3i)。在没有激光照射的情况下，TP5-ICGNFs组由于TP5的免疫调节作用，CD11c+CD80+CD86+比例高于其它组。在激光照射下，ICG添加组(TP5-ICGNFs、HF-ICGNFs、游离ICG)中CD11c+CD80+CD86+的百分比增加，说明光热治疗促进了树突状细胞的成熟。值得注意的是，在所有处理中，“TP5-ICGNFs+laser”组DCs成熟程度最高，至少是其他三组的1.8倍。这说明光热治疗诱导的肿瘤相关抗原与TP5的免疫调节作用共同促进了治疗效果的增强。
图3体外PTT实验及TP5-ICGNFs的免疫调节。a-d)Pan02(a,b)和BxPC-3(c,d)胰腺肿瘤细胞钙黄绿素-AM/PI染色的CLSM图像。染色前，胰腺肿瘤细胞与TP5-ICGNFs(0.05mgmL-1)孵育24h，接着用波长为nm的激光照射(0.6Wcm-2)10分钟；e,f)在暴露于不同浓度的TP5-ICGNFs且有或没有nm的激光照射(0.6Wcm-2)1分钟的条件下，MTT测定Pan02(e)和BxPC-3(f)胰腺肿瘤细胞生存能力；g,h)在传递系统中不同处理后，在没有激光照射(0.6Wcm-2)(h)或激光照射(g)的DC2.4细胞上CD80和CD86分子的表达水平；i)传递系统中DC2.4细胞经过不同处理后的CD11c+CD80+CD86+细胞频数分析。
如图4所示，由于ICG分子在其NFs中的长程有序排列，其增强和稳定的荧光发射可以作为显示药物分布的成像对比，这有助于确定治疗窗口。为了准确反映肿瘤与药物之间的动态反应，将荧光素酶标记的Pan02-luc肿瘤细胞移植到小鼠胰腺，建立原位胰腺肿瘤模型然后绘制治疗图(图4a)。局部注射药物有利于胰腺肿瘤治疗，因为间质障碍阻止药物进入肿瘤组织。因此，作者建立三组小鼠(局部注射TP5-ICGNFs，自由注射ICG和PBS)。注射ICG浓度为1.mgkg-1后，监测各组的荧光信号与时间的关系(图4b)。TP5-ICGNF组和游离ICG组的荧光信号均在15min内增加，然后达到平台期，说明药物在肿瘤部位以相对均匀的状态扩散和分布因此，选择注射后20min为治疗时间窗。此外作者建立阴性对照组，在治疗窗口注射后20分钟，四组中的所有肿瘤(TP5-ICGNFs,HF-ICGNFs、ICG和PBS)相同的平均体积与一个波长nm的激光照射(0.6Wcm-2)10分钟。一个红外热成像系统应用于记录的平均温度变化(图4c和4d)。老鼠的平均温度肿瘤注射TP5-ICGNFs或HF-ICGNFs在10分钟增加到46.5°C，而老鼠注射游离ICG后10分钟内增加到一个较低的温度(42.1°C)。值得注意的是，升高的温度，特别是在TP5-ICGNFs和HF-ICGNFs组，足以损伤肿瘤细胞并诱导免疫原性死亡。这些结果证实了基于ICG的NFs是一种很有前途的具有高效光热转化能力的纳米药物。注射TP5-ICGNFs或HF-ICGNFs的肿瘤发光强度降低(图4e和4h)，而注射自由ICG的肿瘤仅部分抑制肿瘤生长，随后出现肿瘤复发，与对照组的肿瘤没有明显差异。
图4体内光热疗法抑制肿瘤生长。a)肿瘤模型建立示意图及治疗示意图。b)原位注射TP5-ICGNFs、ICG和PBS后不同时间间隔的局限性胰腺肿瘤小鼠的代表性荧光图像。c)不同时间点局部胰腺肿瘤小鼠的红外热像图。小鼠局部注射TP5-ICGNFs、HF-ICGNFs、ICG和PBS，用nm激光(0.6Wcm-2)照射肿瘤组织10分钟。d)激光照射期间胰腺肿瘤的平均温升变化。所有的图都来自于接受浓度为1.mgkg-1ICG注射的小鼠；e)生物发光图像和f)治疗和观察后的局部胰腺肿瘤小鼠MRI图像。小鼠的肿瘤注射TP5-ICGNFs，HF-ICGNFs、ICG和PBS，紧随其后的是波长纳米的激光辐照(0.6Wcm-2)10分钟；g)不同组小鼠肿瘤的照片。h)归一的发光强度；i)归一化MRI信号强度；j)不同实验组小鼠的体重。
本文作者：DSX
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