一、名词解释
1.IU(国际单位）：
在特定的条件下，每分钟转化1μmol底物的酶量为一个国际单位。
2.血浆特异酶：
为血浆蛋白的固有成分，在血浆中发挥特定的催化作用。多数由肝脏合成并以酶原形式分泌入血，在一定条件下被激活，从而引起相应的生理或病理变化。
3.非血浆固有酶：
①外分泌酶：来源于消化腺或其他外分泌腺的酶，它们在血液中的含量与相应分泌腺的功能及疾病有关。
②细胞酶：只在生理情况下存在于各组织细胞中，参加物质代谢的酶类。(分为器官特异酶和非器官特异酶）这类酶细胞内外浓度差异悬殊，细胞损伤可导致血浆中浓度显著升高，最常用于临床诊断。
4.一级反应：
在底物浓度较低的情况下，反应速度随底物浓度的增加而增加，两者接近于线性关系，反应可近似为一级反应。
5.零级反应：
当底物浓度达到一定数值后，继续加大底物浓度，反应速度基本不再增加，反应可近似为零级反应。
6.固定时间法：
将酶与底物在特定条件（缓冲液、温度等）下孵育，经过一定时间后，用终止液终止反应，通过化学或生物化学的方法测出底物或产物的总变化量，除以时间即可计算出底物消耗速度或产物生成速度，以国际单位（μmol/min）或惯用单位表示的酶活性。
7.连续监测法：
将酶与底物在特定条件（缓冲液、温度等）下孵育，每隔一定时间（2s～60s）连续测定酶促反应过程中某一底物或产物的特征信号的变化，从而计算出线性期每分钟的信号变化速率（连续监测法是在多个时间点连续测定产物生成量或底物消耗量，选取线性期的速率来计算酶活性，又称速率法），求出酶活性浓度。
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1.金属酶：
金属离子与酶结合紧密,提取的过程中不易丢失,这类酶称为金属酶。如羧基肽酶（锌）、黄嘌呤氧化酶（铁-钼）等
2.金属激活酶：
金属离子虽为酶的活性所必需，却不与酶直接结合，而是通过底物相连接，这类酶称为金属激活酶。如己糖激酶等
3.可逆性抑制作用：
这类抑制剂以非共价键与酶可逆性结合，使酶活性降低或丧失。采用透析或超滤的方法可将未结合抑制剂除去，则抑制剂和酶蛋白复合物解离，同时酶活性逐步恢复。（竞争性，非竞争性，反竞争性）
4.不可逆性抑制作用：
抑制剂以共价键与酶活性中心上的必需基团相结合，使酶失活，用透析、超滤等方法除去剩余抑制剂后，抑制效应不能逆转。
5.巨分子酶：
血清中有时可出现相对分子质量远大于正常酶分子的一些酶，通常称为巨分子酶或酶的大分子形式，简称为巨酶。
问答题
一、酶含量的表示方法有哪些
据酶是蛋白质和具有高效催化性这两大特性，酶含量的表示方法主要有两种：一种是直接测定酶蛋白的质量并以酶蛋白质量浓度来表示，称绝对定量法。
另一种是根据在特定条件下酶的催化活性与酶含量成正比，以酶活性浓度来表示，称相对定量法。
（一）酶活性浓度表示法
1、酶活性浓度的单位：IU，Katal单位（SI制在规定条件下，每秒钟转化1mol底物的酶量为1kat，1kat=1mol.s-1。常用单位为mkatal或nkatal。）
2、酶活性浓度：单位体积样品中的酶活性单位。（U/L）
3、正常上限升高倍数（ULN）：用测得的酶活性结果除以参考范围上限
（二）酶蛋白质量浓度表示法
利用酶蛋白的抗原性，制备特异性抗体后用免疫学方法直接测定酶蛋白的浓度，以g/L或mg/L来表示。
二、酶蛋白质量检测方法与测定酶活性相比有哪些优点
1）灵敏度高：灵敏度达到ng/Ｌ至μg/Ｌ的水平。
2）特异性高：测定的影响因素较少，几乎不受体液中激活剂、抑制剂的影响，不受药物的干扰。
3）可测定一些酶活性很难测定的酶。如不表达酶活性的酶原或脱辅基的酶蛋白或失活的酶蛋白。
4）与酶活性测定一起，计算免疫比活性，有可能为临床应用提供新的资料和信息。
5）在同工酶测定中的应用：与电泳法和层析法相比，免疫学法测定简单快速灵敏度高，标本量少，重复性好。与化学抑制法相比特异性好。
三、酶活性测定有哪些方法，各有何特点
目前通常按照监测时间不同来分，分为定时法（固定时间法）和连续监测法（速率法）。
(一)定时法：
优点：比较简单，最后测定时因酶促反应已被终止，故所用仪器无需恒温装置，显色剂的选择也可不考虑对酶活性的影响。
缺点：无法知道在整个酶促反应进程中是否都处于线性期。
(二)连续监测法
优点：无须终止酶促反应，不需添加其它成色试剂，就能将反应物变化的多点测定结果连接成线，观察到整个反应过程，选择线性反应期来计算酶活性，结果准确可靠。
要求检测仪器具有恒温装置及自动检测功能，自动生化分析仪都能达到这些要求。
四、何为理论K值，实测K值，校准K值?如何计算测定
（一）理论K值
根据理论摩尔系数及酶测定计算公式中除待测△A/min外的各项数值计算所得到的常数值即理论K值（橙色方框），通常试剂生产厂家给出的K值都属于此
（二）实测K值：
根据仪器当前的实际状态，试剂的稳定性等因素测得的K值。
理论K值受样品和试剂的加量准确度、比色杯光径准确度，尤其是ε的影响。ε在波长和温度等不同时有所不同。试剂说明书的ε可能与实际所用分析仪所测不同。因而有必要获得用户所用分析仪的实际ε，再计算K值此为实测K值。
（三）校准K值：
通过高质量校准直接校准得到的K值。
校准K值=（酶活性U/L）s/（ΔA/min）s
五、连续监测法中理论K值的检验：
最主要的因素就是摩尔吸光系数（ε）
（一）摩尔吸光系数（ε）对一定物质而言常是一个定值，但在一些外界条件影响下也会有所变化。
1、对硝基酚：当pH＞10时，nm处其ε为；pH7.0，ε下降为，颜色下降几乎一半。
2、NAD(P)H：当波长大于nm时，随温度升高，同一波长的ε值会轻度下降。
（二）ε值在近似单色光的光源条件下才能成立。自动分析仪使用干涉滤片，波峰值可能出现差异，半波宽可能为10nm乃至更大。由于杂散光的存在，会明显改变ε值。
（三）注意系统的误差。
（四）双波长检测时，被测物在第二波长存在一定光吸收时，ε值需要进行修正。
六、可逆性抑制作用的动力学变化
1)竞争性抑制作用：
抑制剂和底物的结构相似，能和酶的底物分子竞争与酶的活性中心相结合，从而阻碍酶与底物结合形成ES复合物。
动力学特点：Vmax不变，表观Km增大。
2)非竞争性抑制作用：
抑制剂与酶活性中心外的必需基团结合，不影响酶与底物的结合，酶和底物的结合也不影响酶与抑制剂的结合。
动力学特点：Vmax降低，表观Km不变。
3)反竞争性抑制作用：
酶只有在与底物结合形成ES复合物后，才能与抑制剂结合，即ES+I?ESI。当ES与抑制剂结合后，ESI不能分解成产物，酶活性被抑制。
动力学特点：Vmax降低，表观Km降低。
七、酶促反应进程在酶学检测中的应用
（一）酶促反应进程：
1、延滞期：酶促反应开始至达到最大反应速度所需要的时间。
2、线性期：酶促反应速度保持恒定的时期，不受底物浓度的影响。
3、非线性期：随着反应时间的延长，底物消耗越来越明显，酶促反应速度明显下降，偏离线性而进入非线性期。
（二）酶偶联反应
酶偶联反应有一个明显的延滞期。反应一开始只存在底物A，不存在指示酶的反应，随着产物B的出现和增加，指示酶反应随之加快，Ex和Ei反应速度相等，也就是达到稳态。从酶反应开始至稳态期间，称为延滞期。
用酶偶联反应测酶活性浓度时，最好条件应是测定酶反应为限速反应，动力学上为零级反应。指示酶为一级反应，酶反应速度与指示酶底物浓度相关。
八、IFCC推荐法测定ALT的反应进程
（一）定时法/连续监测法
连续监测法根据连续测得的数据，只选择线性期的底物和产物变化速率用于计算酶活力。而定时法测得的酶活性是酶促反应的整个过程中的平均速度，有可能包括延滞期和非线性期。
（二）底物启动模式/样品启动模式
1)底物启动模式：样品先与部分试剂（缺乏某个底物）预孵育一定时间，然后加入这个底物，样品中的待测酶酶促反应才开始启动。优点：在待测酶酶促反应开始之前，可以除去某些干扰物，包括内源性干扰物和外源性干扰物。需要双试剂剂型，IFCC推荐法多采用底物启动模式。
2)样品启动模式：反应所需的试剂先混合在一起，然后加入样品，依靠样品中的待测酶来启动酶促反应，在延滞期去除部分干扰物，可采用单一试剂剂型。
九、何为同工酶，简述检测方法，举例说明其应用
同工酶：同一种属中由不同基因或等位基因编码的多肽链单体、纯聚体或杂化体，具有相同的催化作用，但其分子构成、空间构象、理化性质、生物学性质以及器官分布或细胞内定位不同的一组酶。
检测方法/应用：
十、巨分子酶的特性
(1)分子量大，在体内不易排出，也不易被巨噬细胞系统吞噬而降解，又因其有较长的半衰期，故在血中存留时间较长。
(2)在常规生化检测中往往易引起酶活性假性升高及同工酶的改变。
(3)它的存在干扰了酶测定的正确性，极易造成酶测定结果的错误判断和临床误诊。
十一、酶催化特性在酶学检测中的应用
常用诊断酶的测定
一、丙氨酸氨基转移酶（ALT）
二、门冬氨酸氨基转移酶（AST）
ALT：男性：9～50U／L，女性：7～40U／L（37℃）
AST：8～40U／L（37℃）
ALT是肝损伤的一项很灵敏的指标。急性肝损害时，血清ALT水平可在临床症状（如黄疸）出现之前就急剧升高，且ALT＞AST。
DeRitis比值，即AST/ALT之比。急性肝炎时DeRitis比值＜1，肝硬化时DeRitis比值≥2，肝癌时DeRitis比值≥3。
重症肝炎时，血中ALT逐渐下降，而胆红素却进行性升高，出现所谓“酶胆分离”现象，
胆道梗阻时，ALT中度升高，梗阻缓解后1～2周即可恢复正常。AST亦可升高。
慢性肝炎特别是肝硬化时，AST升高程度超过ALT。
（1）LD：用兔肌来源的干粉制剂，加入白蛋白和叠氮钠来保持其活性，应没有GLDH和ALT的污染。
（2）α-酮戊二酸用量：15mmol/L，基本满足了ALT最适条件对α-酮戊二酸的用量的要求，扩大了测定范围，提高了测定准确性。
（3）缺陷：存在内源性丙酮酸和GLDH的干扰，采用双试剂底物启动模式可以消除部分干扰，延长延滞期也可以消除部分干扰。
（4）预孵育目的：使试剂中磷酸砒哆醛与部分脱辅基的酶先结合。使脱辅基的酶恢复酶活性。
三、γ-谷氨酰基转移酶（GGT）
测定温度37℃，健康人群：
男性：11～50U/L，女性：7～32U/L
γ-GT是肝胆疾病检出阳性率最高的酶，主要用于胆汁淤滞及肝占位性病变的诊断。
肝内外阻塞性黄疸患者血清γ-GT均显着升高，其幅度与阻塞程度呈正相关
病毒性和肝硬化患者γ-GT亦可呈中度升高，但不及阻塞性黄疸明显。
γ-GT显著性升高是酒精性肝病的重要特征
肝癌患者γ-GT活性显着升高，动态观察可监测疗效、判断预后。
γ-GT同工酶分为γ-GT1、γ-GT2、γ-GT3和γ-GT4四种。
（1）反应温度37℃时的最适pH：7.70，以甘氨酰甘氨酸和氢氧化钠做缓冲体系。
（2）5-氨基-2-硝基苯甲酸在nm的摩尔消光系数为7.96*（pH为7.70），受pH和温度影响较大。
（3）GCNA的纯度要求：对硝基苯胺应小于0.5%，5-氨基-2-硝基苯甲酸应小于0.1%。
（4）底物自身：酶活性计算时应扣除试剂空白变化速率。
四、胆碱酯酶（ChE）
人体内主要存在两类胆碱酯酶：
一是假性胆碱酯酶（pseudocholinesterase，PChE），又称血清胆碱酯酶、丁酰胆碱酯酶或胆碱酯酶Ⅱ，临床常规检查的即为此酶，通常称为ChE（这里讲的就是ChE）；
二是存在于神经突触处的乙酰胆碱酯酶（cetylcholinesterase，AChE），又称真性胆碱酯酶或胆碱酯酶Ⅰ。
~U/L
增高：见于神经系统疾病、甲状腺功能亢进、糖尿病、高血压、支气管哮喘、Ⅳ型高脂蛋白血症、肾功能衰竭等。
减低：见于有机磷中毒、肝炎、肝硬化、营养不良、恶性贫血、急性感染、心肌梗死、肺梗死、肌肉损伤、慢性肾炎、皮炎及妊娠晚期等，以及摄入雌激素、皮质醇、奎宁、吗啡、可待因、可可碱、氨茶碱、巴比妥等药物。
1、CHE是血清固有酶，酶含量高，若反应速率超过酶反应线性范围需将样品稀释后测定。
2、从酶动力学进程分析，采用双试剂，试剂1中的DTNB先与血清孵育可以消除干扰物，再用底物启动酶促反应可以得到较好的线性期。
3、血红蛋白可干扰本反应，因此样品应避免溶血。
五、肌酸激酶（CK）
男性为80~U/L，女性为60~U/L。
较早期诊断AMI，估计梗死范围大小或再梗死。
血中超过正常：发作后4～6h。达峰值时间：24h。回复正常：48～72h。CK半寿期：10～12h。
（1）缓冲液和pH：醋酸咪唑缓冲液。
（2）巯基激活物：CK是巯基酶，需要巯基试剂活化。常用N-乙酰半胱氨酸；
（3）腺苷酸激酶的干扰和消除：红细胞含有大量腺苷酸激酶(AK)，使CK活性假性增高。常用的AK抑制剂以二腺苷-5-磷酸(AP5A)和AMP联用效果最好。
（4）EDTA的作用：Mg2+作激活剂，各法配方中均含有Mg2+。但样品中的Ca2＋是Mg2＋的竞争性抑制剂，加入EDTA既可以络合样品中的Ca2＋又能防止N-乙酰半胱氨酸由于二价离子的催化发生的氧化，有利于试剂的稳定。
（5）样品保存：CK活性不稳定，血清样品室温4小时、4℃8～12小时、冰冻下2～3天维持活性不变，由温度增加引起的灭活是不可逆的，加入巯基试剂不能恢复。样品采集后应尽快分离血清，保存于4℃冰箱。
六、乳酸脱氢酶（LD）及其同工酶
成人血清LD：U/L~U/L
1.LD活性增高：目前临床测定LD活性常用于心肌梗塞、肝病和恶性肿瘤的辅助诊断。
2.LD活性降低：目前没有发现重要的临床意义。
3.LD的特异性差，几乎存在各种组织中，如：心、肺、肾、肝、骨骼肌以及恶心肿瘤等疾患时均致此酶增高。
1、37℃时最适pH为9.4，使用Tris缓冲液不合适。
2、在各类乳酸盐中，乳酸锂首选。关于NAD+应选择游离酸型与锂盐的混合型（游离酸：锂盐=1：5）
3、LD4和LD5对冷不稳定，故样品不宜冰箱存放
4、M和H亚基的理化性质相差悬殊，很难兼顾
七、淀粉酶（AMS）
碘-淀粉比较法
血淀粉酶：80~U/dl，尿淀粉酶：~1U/dl
急性胰腺炎、胰腺外伤、胰腺管阻塞等疾患时，血液、尿液中淀粉酶均增加。
急性胰腺炎，从发病2h开始血清淀粉酶活性迅速上升，12～24h间达最高峰，多在参考值上限4倍以上，3～4天降至正常。
慢性胰腺炎淀粉酶上升不如急性胰腺炎时显著，多为一过性，日间变化也大。为此须反复测定血清淀粉酶，更重要的是在晚饭后2h测定尿液淀粉酶，连续检查三天，从慢性胰腺炎发展成为胰腺萎缩、胰腺硬化时，淀粉酶活性则呈现低值。
胰腺癌者的淀粉酶活性，一般在早期增高，到晚期降低。
血淀粉酶增加，除见于胰腺疾患外，还见于腹部疾患等。腮腺炎时血清淀粉酶也可轻度升高。肾功能不全，各种外科手术后，服吗啡、可待因等药物后血清中淀粉酶也见上升。
（1）HEPES缓冲系统随着pH升高PNP的摩尔消光系数会加大。
（2）α-葡萄糖苷酶对底物有缓慢的水解作用，若将PNP-G7的非还原端葡萄糖残基接上保护基团封闭，就可以阻止α-葡萄糖苷酶对底物的水解作用，提高底物的稳定性。
（3）多功能α-葡萄糖苷酶对EPS的所有降解产物都有相同的转换率。
以后，在