胰腺癌是一种恶性程度高、诊断和治疗都很困难的消化道恶性肿瘤，是实体肿瘤中死亡率最高的癌症，患者的5年生存率小于10%。其中胰腺导管癌（Pancreaticductaladenocarcinoma）占所有胰腺癌的85%。目前，通过手术切除肿瘤病灶是最主要的治疗方式，其中约15~20%的患者可以通过胰腺摘除的方式进行治疗。
基因组水平上，与其他肿瘤一样，胰腺癌也是由于各种基因突变经年累月的积累导致的。目前在分子水平已经明确，诸如CDKN2A、SMAD4和TP53等抑癌基因、KRAS等原癌基因的突变是胰腺癌的驱动事件，并且这些基因所涉及的信号通路让我们对其机理有了深入的理解，但真正具有临床应用价值的基因变异还是很少。
本期介绍的成果涉及2个前瞻性研究，试图探讨基因组改变在胰腺癌中的临床意义，这些基因不仅包括了染色质调节相关的基因，也包括了和靶向治疗相关的目标基因。研究人员对24例肿瘤样本进行了全外显子组分析，并对77例肿瘤样本进行了目标基因分析，同时使用非侵入性的方法来检查患者血液内的循环肿瘤DNA。
样品和方法
24名患者成对的肿瘤组织样品和正常组织样品，进行全外显子组测序（whole-exomeanalyses），超过20,个基因，coverage为X。NGS设备：HiSeq2/和IlluminaMiSeq。
77名患者的肿瘤组织样品，对个特定基因进行目标区域测序（targetedgenomicanalyses），coverage为X。NGS设备：HiSeq2/和IlluminaMiSeq。
利用NGS发现胰腺癌基因组水平的同时，采用数字PCR对患者血液内循环肿瘤DNA（ctDNA）中的特定突变进行检测，并对患者在手术治疗后的复发风险作出评估。具体检测的突变位点以KRAS基因为主。数字PCR设备及assays：Bio-RadQX及PrimePCRKRAS、BRAF、PIK3CA检测试剂盒。
NGS分析结果
全外显子组测序发现：每个病患中平均含有个非同义突变，目标区域测序发现每个患者体内的非同义突变平均数为4.7个。
在能导致胰腺癌复发的已知基因中，分别测到了不同频率的突变，如KRAS（88%），TP53（77%），SMAD4（29%），CDKN2A（18%）和TGFBR2（7%）。
除了上述和复发有关的基因外，还在染色质调节、修饰相关基因中发现了体细胞的突变。如组蛋白甲基转移酶（MLL3，9%），ARID1A基因（AT-richinteractivedomain-containinggene，7%）。在测得的6种ARID1A基因变异中，包括了无义突变和移框突变。
在MLL3基因的突变中，包括了非同义突变、无义突变、移框突变及剪切位点的突变，且这些突变几乎都对应保守的氨基酸区域。MLL基因突变十分独特，每位患者的MLL基因中仅会有一种突变，从未发现过两种或两种以上的突变，也许这意味着MLL基因突变对于形成肿瘤的选择十分强势，仅一个突变就足以产生细胞的癌变。
研究还证实了MLL和ARID1A基因的突变非但会引起细胞内广泛的蛋白表达水平变化，还与患者的生存期存在相关性。例如含有MLL和ARID1A基因突变的患者其存活期显著高于野生型患者，具体结果见下图。
早期胰腺癌患者的血液检测
利用数字PCR对51名患者血浆中的KRAS突变进行检测，22名患者中可测得KRAS突变，检出率为43%，特异性达99.9%。和其他研究的结果一致，即使在早期的胰腺癌患者血液也可以发现特定的突变基因。（直接回复数字“”进入相关阅读）
对部分手术后患者进行连续血液突变检测，结果发现血液内ctDNA阳性患者较阴性患者具有更高的复发率（P=0.02），手术切除后检出ctDNA意味着可能的复发和较差的预后。
利用ctDNA的数字PCR检测，比较于传统的影像学检查如CT，能够更早地发现患者的PD（progressivedisease）。前者可在术后平均3.1个月即发现ctDNA，而CT在术后平均9.6个月才能发现PD。这意味着通过无创的血液ctDNA检测，能够对患者的复发进行预测，并作为术后病情进展的监控手段之一。具体结果见下图。
陈斯卡观点
本文以胰腺癌研究为例，展现了NGS+dPCR联合分析在肿瘤研究方面的流程，这种流程越来越有望成为一种“标准流程”。前者的优势在于全基因组水平上对各种基因变异的“批处理”能力，后者的优势在于特定基因突变位点检测的灵敏度。
NGS+dPCR的联合使用不仅仅是一种标准的研究流程，也将在肿瘤液态活检这个应用市场大有作为，目前国内一些公司已经利用这2种技术平台开始提供服务和产品研发。小平同志曾经指出：两手都要抓，两手都要硬！重要的流程图再贴一次。
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