人羊膜上皮细胞用于治疗多发性硬化症
作者：CourtneyMcDonald,ChristopherSiatskasandClaudeC.A.Bernard
作者单位：莫纳什大学，免疫和干细胞实验室，多发性硬化症研究组
多发性硬化症（MultipleSclerosis，MS）是中枢神经系统的自免性疾病，目前已经有多种免疫调节剂被用来治疗这种疾病，但是有效性都相对很低，而更关键的是，这些免疫抑制剂的使用都不可避免的伴随着副作用，而这些免疫抑制剂的作用只是延缓了疾病的进程，并没有将疾病治愈。因此，现在迫切需要开发新的、副作用更小的、能治愈更多患者的治疗方法。其中一个这样的潜在的治疗方式就是干细胞的使用。已经证明，多种不同类型的干细胞在治疗大鼠MS模型中是有效的，这样就为他们在临床上的潜在应用奠定了基础。一种正在引起越来越多研究者注意的新型干细胞来源是羊膜上皮细胞。已经证明，羊膜上皮细胞可以移植，抑制炎症反应，迁移到中枢神经系统的炎症部位，向神经系统细胞系分化。考虑其免疫抑制和神经系统再生潜力，羊膜上皮细胞被用来治疗MS和其他影响中枢神经系统的炎症疾病和神经退行性疾病。
1.简介
多发性硬化(MS)在全世界范围内影响了万人，其特征是中枢神经系统的炎症性疾病。该疾病的主要病理特征是脱髓鞘斑块，包括免疫细胞浸润、局部髓磷脂破坏、少突胶质细胞丢失和轴突变性。这种疾病最常发生在20~40岁的人群中，且男女患病之比约为1∶2。MS的症状通常是多变的，但是最突出的临床表现包括：虚弱，一个或多个肢体功能丧失，视力模糊，共济失调，膀胱功能障碍，疲劳，记忆丧失和麻痹。MS是不明原因的多因素疾病，然而，现在已经表明遗传背景和暴露于特定的环境因素增加了患MS的几率。来源于大鼠MS模型，比如实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的数据表明，这种疾病是由自身免疫系统不断的攻击中枢神经系统的自身抗原引发的，这些自身抗原包括髓鞘蛋白如髓鞘碱性蛋白（MBP），蛋白脂质蛋白（PLP），髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG），少突胶质细胞特异性蛋白（OSP）和可能的αβ晶状体蛋白。
1.1多发性硬化的临床分类
多发性硬化常分为四型，包括：复发缓解型（RR）、继发进展型（SP）、原发进展型（PP）、进展复发型（PR）。（1）PP-MS是MS的最常见的病程类型，80%MS患者发病初期为本类型，表现为神经神经功能障碍的突然发作，随后是缓解期，有时是完全恢复期，约50%患者会由PP-MS转变为SP-MS。（2）SP-MS表现为残疾水平稳步上升，几乎没有恢复期。炎症和脱髓鞘进程的减少、神经变性的增加被证明是PP-MS转变为SP-MS的可能的原因。然而，关于这个问题的意见仍然存在分歧。（3）PP-MS是MS中最严重的类型，大约有10%的MS属于这一类型，表现为疾病从开始时持续的神经恶化，没有明显的缓解期。（4）PR-MS，5%?10%MS患者表现为本类型，疾病始终呈缓慢进行性加重，病程中有少数缓解复发过程。
1.2目前MS的治疗方法
遗传和环境因素可以增加MS的发病率，但是MS明确的发病原因还没有被清楚定义。尽管人们已经投入了大量时间和经历去试图了解和治疗这种疾病，但目前还没有办法治愈MS。尽管如此，目前用于临床的大多数药物，比如：贝他费隆、醋酸格拉替雷、那他珠单抗、芬戈莫德等，发挥免疫调节和免疫抑制的作用。这些治疗方式对大约30%的PP-MS病人有效，主要因为这些药物对疾病进展的影响不大，所以对进展性疾病患者的疗效有限。出于这个原因，显然需要改进治疗方法，以提供神经保护，并防止疾病向慢性残疾发展，为了达到这一目的，未来的治疗策略将需要结合免疫调节和神经保护机制。目前的临床实践充其量只能针对该疾病的炎症成分。
1.3干细胞广义来说，已经定义了两类干细胞，即胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞能够分化成三个胚层来源的细胞，理论上可以在培养基中无限自我复制，为受损组织的再生提供无限的前体细胞来源。成体干细胞能够分化、维持和修复他们被分离出来的组织，比如：骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）可以分化成中胚层能够生成骨和脂肪的细胞系，因为这种间充质干细胞也具有很强的免疫抑制作用，所以理论上，针对多发性硬化症的炎症过程，以及潜在的促进和/或增强自发的髓鞘再生是非常理想的治疗方式，而且目前在英国，正在进行1~2个小型Ⅰ/Ⅱ期临床实验，不久前在美国也在开展这种临床试验，评价间充质干细胞治治疗MS的安全性和有效性。然而，这两种干细胞的来源使得这两种干细胞的使用受限，比如ESCs所表现出的自发分化或伦理问题，而成体干细胞数量的不足限制了它们在成体干细胞自体移植中的应用。
引起干细胞研究领域兴趣的另一种干细胞来源是羊膜上皮细胞（amnionepithelialcells，AECs），这些细胞来源于废弃的胎盘，并且已经证明，具有与胚胎干细胞和间充质干细胞相似的性质。考虑到只是在澳大利亚，每年就有大约30万新生儿，羊膜为再生细胞材料提供了丰富的来源，并且不受胚胎干细胞所面临的伦理限制问题所困扰。与胚胎干细胞相似，羊膜上皮细胞是多能性的，也可以在培养基中自我复制，非常重要的与胚胎干细胞和从其他组织中获得的间充质干细胞相反的是，羊膜上皮细胞不会形成畸胎瘤。更重要的是，羊膜上皮细胞表现出很强的免疫调节、免疫抑制特性，因此，为潜在的临床应用提供了显著的优势。
1.4干细胞在EAE中的使用
EAE，实验性自免性脑脊髓炎，是最常用的研究MS的动物模型。移植人和鼠来源的MSC、神经前体细胞给EAE大鼠，能够改善其疾病的临床表现，减轻病症。目前，间充质干细胞发挥作用的机制仍然不清楚。值得一提的是将MSCs通过脑室注射移植到EAE大鼠体内，这些细胞会自我迁移到中枢神经系统中的炎症区域，对这些归巢的细胞分析后会发现，这些细胞可以上调神经标记，比如半乳糖脑苷脂（GalC）,少突胶质细胞标记O4，胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）、β-微管蛋白-3，表明细胞的分化是朝着神经细胞系，因此表明MSCs可能会促进再生的过程。然而，值得注意的是，虽然细胞替代是骨髓间充质干细胞发挥作用的潜在机制，但并不排除这一过程也涉及细胞融合事件，而不是细胞替代。事实上，造血干细胞，包括骨髓间充质干细胞，与浦肯野神经元广泛的融合，已被证明会在病理情况下发生，如慢性炎症。除了具有的神经元再生特性，脑室注射MSCs还表现出全身性免疫调节作用，包括降低T细胞对髓鞘抗原的应答能力，减少神经系统炎症，改善轴突完整性，降低EAE的严重程度。MSCs在中枢神经系统发挥免疫调节作用的机制还有待进一步完全确定，但这可能是通过上调α4整合素，使间充质干细胞粘附在炎症的脑血管内皮细胞上发挥作用的。注射间充质干细胞还可以增强内源性少突胶质前体细胞募集到脱髓鞘区域，从而帮助再生过程。这包括直接的细胞接触或者是营养因子的释放还有待阐明。
值得注意的是，像MSCs一样，神经前体细胞（NPCs）也能够影响EAE的发展。EAE模型建立后很快将NPCs通过脑室注射到EAE大鼠体内，NPCs会迁移到白质，帮助减少炎症和损伤，并降低EAE临床严重程度。有趣的是，注射到脑室的NPCs会迁移到中枢神经系统炎症和脱髓鞘部位，这些细胞似乎分化为成熟的脑细胞，通过表达神经元标记物NeuN和少突胶质前体标记PDGFα来表现。而这些成熟的脑细胞会导致髓鞘反应性星形胶质细胞增生活跃，这一过程会阻碍轴突髓鞘的再生。
综合以上这些结果，MSCs和NPCs可以提供一种调节炎症的中枢神经系统激活T细胞的方法，以及促进组织修复的方法。考虑到AECs具有与MSCs和NPCs相似的功能，这些细胞应该被认为是治疗炎症和神经退行性疾病，比如MS的一种可能的选择。
2.羊膜的发育、结构和功能
在发育过程中，羊膜起源于外胚层，形成了胎盘的最内层，包裹着羊水和胎儿。羊膜的构成包括一层与羊水直接接触的上皮细胞，称为羊膜上皮。这些上皮细胞能分泌糖蛋白，构成基底膜胶原和层粘连蛋白。在上皮层下方是羊膜中胚层，包括致密的间质层和成纤维细胞层。两种不同胚层来源的细胞出现在羊膜中，羊膜上皮细胞来源于胚胎外胚层，羊膜间充质细胞来源于胚胎中胚层。羊膜基本的功能是为正在发育的胚胎提供保护，使其免受外来的伤害。羊膜提供了一个支持性的环境，在这个环境中，胚胎可以不受周围器官压力的影响而生长；羊膜的另一个功能是为胎儿提供保护，使其免受感染和毒素伤害。
（图1：羊膜的结构：羊膜是位于最内层的膜，包裹着胎儿，就是上图中蓝色最外面的那部分。这层膜提供了结构支持，由两层独立的膜组成，即羊膜上皮层和羊膜间充质层，由基底膜分离开来。羊膜间充质层也由两部分组成，即紧凑的基质层和纤维母细胞层。羊膜直接在往外是绒毛膜层和滋养层。羊膜中有两种干细胞样细胞，羊膜上皮细胞存在与羊膜上皮层，羊膜间充质干细胞存在于羊膜中胚层。）
人们对于羊膜上皮细胞存在的最常见的误解是认为羊膜上皮细胞来源于胚胎外组织。其实羊膜上皮细胞来自于胚胎分化到第8天时出现的上胚层，这个时间点的细胞具有多能性，能够分化成人体的所有组织。这个时间点在原肠胚形成之前，细胞的分化命运在原肠胚期被决定。
（图2：羊膜发育示意图：胚胎形成的第8天，内细胞团分化成上胚层和下胚层。直接与滋养层相毗邻，羊膜外胚层来源于内细胞团。羊膜外胚层稍后形成羊膜上皮层。）
3.羊膜上皮细胞的多能性
AECs很容易通过机械和酶消化分离，每一张羊膜大约可以收获2个亿左右的细胞。一旦收获，这些细胞可以很容易地在有血清或无血清条件下培养。所有干细胞的都具有的一个非常明显的特征就是它们能够分化成体内各种细胞类型。由于羊膜上皮细胞来自于上胚层，处于胚胎发育早期，因此拥有高水平的多能性。羊膜上皮细胞能够表达胚胎干细胞的表面标记，包括：OCT-4,nanog,
SSEA-3,SSEA-4,TRA1-60andc-kit，也能够表达MSCs的表面标记，包括CD90,CD44,CD和CD，这表明AECs可能具有与MSCs相似的功能。研究表明，羊膜上皮细胞可以分化成三个胚层来源的细胞，包括内胚层、中胚层和外胚层。值得注意的是，它们可以产生与临床相关的细胞类型如心肌细胞，肌细胞，骨细胞，脂肪细胞，胰腺细胞，肝细胞，以及神经细胞和星形细胞。一个AECs明显超过MSCs的明显的优势是将AECs移植到动物或者人体内，不会形成畸胎瘤。
4.羊膜上皮细胞的免疫特性
对于羊膜上皮细胞的免疫豁免特性，目前还有一些争议。一些研究发现，AECs不表达人类白细胞抗原HLA-A、B、C，这表明移植AECs以后，不会发生免疫排斥。然而，其他的一些报道证明，AECs可以表达HLA-Ⅰ。尽管在HLA-Ⅰ的表达上面存在差异，但是很明确的是AECs不表达HLA-Ⅱ型抗原，也不表达共刺激因子CD86和CD80。此外，经过IFN-γ处理后不表达HLA-Ⅱ表明AECs可能被活化的免疫系统掩藏，鉴于宿主CD4+的T辅助细胞活化，在理论上是有限的。更重要的是，AECs表达HLA-G，一种非HLA-Ⅰ抗原。胚胎中可溶解的HLA-G的出现伴随着怀孕率的增加，并且HLA-G被用来作为辅助生殖胚胎选择的非侵入性标记。HLA-G一个可能的作用是为胎儿提供保护，免受母体免疫系统的排斥。因此，假设在异体移植背景下，HLA-G的表达是能够避免免疫系统的监视的。尽管这种现象背后的机制不是完全清楚，但是已经证明，HLA-G能够诱导激活的CD8+细胞凋亡，抑制CD4+细胞增殖。AECs细胞表面表达HLA-G是持续的，但是在原代培养中会慢慢减少。有趣的是，在IFNγ存在的时候，AECs表面表达HLA-G会恢复。在使用这些细胞进行临床应用的情况下，这些结果表明，在炎症环境下，AECs可以逃避激活的免疫系统，从而导致它们在宿主环境中的持久性增强。AECs逃离免疫系统的另一个机制是分泌免疫调节因子。实际上，hAECs培养基的上清液具有抑制先天免疫系统和适应性免疫系统细胞的能力，主要是通过细胞凋亡减少T细胞和B细胞增殖。比如，甲胎蛋白，AECs和MSCs生成的免疫调节蛋白，能够通过调节免疫细胞凋亡来减少EAE大鼠模型的淋巴细胞的反应性，抑制炎症反应的程度。此外，体外实验已经证明AECs对外周血单个核细胞（PBMC）在混合淋巴细胞的免疫应答，以及用细胞分裂素，植物血凝素（PHA）刺激的T细胞培养物的免疫应答中表现出剂量依赖性抑制。这种抑制涉及的机制之一可能是AECs对应答器CD4+细胞的作用，主要是通过减少CD4+的增殖，减少了Th1和Th2细胞因子的数量。另外，AECs能够分泌抑制中性粒细胞和巨噬细胞迁移的因子，其中之一就是巨噬细胞抑制因子（MIF），MIF可有效抑制巨噬细胞活性和NK细胞介导的细胞凋亡，其他的非常重要的有助于AECs抑制免疫应答的因子包括：Fasligand，TRAIL，TGF-β。
（图3：AECs的免疫抑制/免疫调节特性。（i）AECs表达HLA-G，可以抑制CD4+T细胞的增殖和诱导CD8+T细胞的凋亡，HLA-G也可以被IFNγ上调；（ii）AECs能够分泌很多可以抑制T细胞和B细胞的因子，包括AFP，Fasligand，TRAIL，TGF-β和MIF；（iii）已经证明，AECs能够调节宿主免疫系统，主要是通过抑制TNFα，IFNγ，MCP-1和IL-6的生成，增加抗炎因子IL-10的生成）
就上述这些AECs的特性而言，已经开展了很多试验，评估了它们的免疫调节特性。移植到眼表以后，AECs可以创造一个微环境，调节周围的炎症反应，AECs的这个作用是抑制了MHC-Ⅱ抗原提呈细胞出现在发炎的眼角膜上，因为CD4+和CD8+细胞浸润减少。在由博来霉素，一种非常有效的肺纤维化刺激因子所致的炎症肺损伤模型中，AECs调节宿主炎症应答，减少肺纤维化，阻止肺功能的丧失，这种效应伴随着促炎性细胞因子的减少，比如：TNFα、IFNγ、MCP-1、IL-6，导致了炎症细胞浸润减少，抗炎因子IL-10增加。
鉴于有关羊膜上皮细胞对自身免疫介导的脱髓鞘模型中的免疫应答的作用缺乏有效的数据，作者开始探讨AECs调节TCR-依赖的或者独立的T细胞增殖的能力，以及对EAE的作用。体外实验证明，AECs可有效减少MOG-特异性T细胞的增殖，AECs还可以有效减少促炎因子IFNγ和TNFα的分泌。作者实验室初步研究表明，在第8天的时候，通过腹腔注射万AECs到EAE大鼠体内，可以观察到症状明显改善，减少了中枢神经系统炎症、脱髓鞘以及轴突的退化。总之，这些结果表明了AECs抑制EAE发展的一个可能的机制。
（图4：腹腔注射AECs抑制RR-EAE的发展。(A)65μgrMOG在CFD中乳化，然后和ng的百日咳毒素一起在第0d和第2d通过腹腔注射打到雌性NOD/lt大鼠体内，建立EAE模型。然后在第8d将万的AECs或者相同体积的PBS注射到大鼠腹腔（上图箭头所指得时间）每天监测大鼠疾病发展的情况，根据以下标准进行评分：0-无疾病；1-跛行；2-后肢虚弱；3-后肢无力；4-前肢和后肢都无力；5-濒临死亡。结果表明在第8d注射AECs可有效延迟并且降低EAE的严重程度。（B）转基因2D2鼠，用20μgMOG35-55单独或者和AECs以1:5和1:25来刺激MOG-特异性T细胞的增殖，结果表明AECs可以有效抑制T细胞的增殖。将AECs和MOG特异性T细胞共同培养，72h收集培养液的上清液，检测IFNγ（D）和TNFα（C）的浓度，结果表明AECs可以有效减少促炎因子的释放）
5.向中枢神经系统的募集
任何一种干细胞能够在临床上使用的一个非常重要的方面是他们有向目标受损区域归巢的能力。虽然对于在移植部位AEC是如何迁移的机制知之甚少，但有几项研究清楚地定义了指导成体干细胞在受伤部位内迁移的分子，比如：已经证明，MSCs可以分泌许多不同的趋化因子、细胞因子、生长因子，并且表达多种趋化因子的受体。比如CXCR4，在干细胞向缺血性脑损伤区域归巢发挥了重要的作用。值得注意的是，CXCR4也在EAE模型中淋巴细胞和单核细胞向中枢神经系统的募集过程中发挥了重要作用。最近，也有研究表明CXCR7对中枢神经系统中中间神经元的募集有重要作用。这些趋化因子受体也涉及到淋巴细胞跨越血脑屏障的募集。有趣的是，AECs可以表达CXCR4和CXCR7，考虑到这些功能与MSCs相似，所以我们绝对有理由认为这些受体有助于AECs向中枢神经系统的募集，证明了AECs具有的归巢的能力。
6.移植的羊膜上皮细胞在宿主体内存活和分化的能力
AECs在多种疾病模型中的有效性，突出体现在其可以在宿主组织内存活，分化成特定谱系细胞的能力。在CCl4诱导的肝脏疾病模型中，移植AECs可以在宿主肝脏内存活，抑制了肝脏细胞的凋亡，减少了炎症和纤维化。此外，静脉注射AECs到免疫缺陷的肺损伤大鼠模型体内，可以在宿主体内存活，并且生成表面蛋白A、B、C、D。同样的，直接移植AECs到糖尿病SCID大鼠模型的脾脏，AECs会整合到宿主的脾实质内。值得注意的是，移植一个月以后发现AECs存在于胰岛素生成部位，比如肝脏和胰腺。AECs也在中风模型和脊髓损伤模型中有过研究。这些研究表明，移植的AECs能够有效迁移到中枢神经系统，并且能朝着神经元细胞系分化，这点是通过标志分子nestin和MAP2的表达来说明。一些研究者发现移植的AECs能够在宿主体内存活60d，这表明AECs可以免受神经系统的排斥。腹腔注射AECs到新生的大鼠和猪体内，AECs会微嵌合到很多器官，包括肺、骨髓、脾脏、肾、肝和更重要的大脑。在用AECs治疗中枢神经系统相关的疾病时，这些数据支持AECs能够归巢到中枢神经系统，跨越血脑屏障，减少炎症，再生受损的组织。
7.AECs再生神经元细胞系的细胞以及帮助宿主修复的潜力
7.1神经元分化
由于炎症是MS疾病进程中非常重要的一个病理过程，MS还表现为明显的神经退行性改变，伴随着少突胶质细胞和轴突的损伤和丢失。因此，任何成功的MS治疗方法不但要抑制炎症、还要再生或者置换受损或丢失的组织。AECs为这个问题的解决提供了方案，因为AECs可以分化成多种类型的神经元细胞类型。尤其是AECs表达大量的出现在成熟和不成熟神经元和胶质细胞表面的标记，比如：MAP2、GFAP，神经干细胞标记nestin。考虑到新采集的羊膜大量表达这些神经元标记，极有可能这些细胞已经准备好了向神经元细胞系分化。此外，已经证明分化的AECs获得功能活性，主要是可以合成和释放乙酰胆碱，儿茶酚胺，多巴胺，神经营养因子等。基于这些特性，多位研究者已经开展了多项AECs用于治疗各种神经退行性疾病模型的研究。帕金森疾病模型，杨和他的同事等人将AECs注射到大鼠的侧脑室，发现移植AECs5w以后，大鼠的旋转不对称改善，在中枢神经系统可以检测到移植的AECs，并且表达巢蛋白和波形蛋白。在出血性中风模型中，脑损伤和退化出现，将AECs移植到大脑，发现AECs存活至少4周，脑水肿减少，运动缺陷改善。在中脑动脉梗塞疾病模型中，移植的AECs可以表达BDNF，AECs可以迁移到缺血部位，维持神经元标记MAP2、巢蛋白和GFAP的表达。此外，在这些疾病模型中，大鼠的运动障碍被改善，与疾病相关的梗塞面积减小。总的来说，这些实验表明，AECs可以很容易地在体内进行神经分化，而且具有归巢到损伤部位的能力。
7.2促进宿主的修复
除了可以替代受损细胞以外，AECs还可以为宿主组织干细胞的生长和分化提供有力支持。这个特点已经被证明是独立于细胞-细胞间的接触，正如来源于AECs的培养液可以有效提高神经干细胞体外培养的存活率。鉴别hAECs分泌的神经营养因子，包括BDNF、NT-3、神经生长因子和新的表皮生长因子。大量的移植实验已经进一步确认AECs能促进神经细胞的存活和发展。在啮齿SCI动物模型中，将AECs直接注射到横断腔，会造成宿主轴突的辅助穿透与胶质瘢痕形成的完全消除。还有另一个实例是，将过表达bFGF的AECs与NSCs共移植，与单独移植NSCs相比，运动功能显著改善。总之，这些结果表明，AECs有能力促进内源性神经干细胞的存活和分化。
8.AECs在临床中的应用
既然AECs在促进炎症和神经退行性疾病的治疗方面很有前景，一个非常重要的、关于他们的使用的问题是：一旦移植到病人身上，是否安全。值得注意的是，羊膜和羊膜上皮层已经在临床上使用，治疗一些疾病超过30年。早在年，羊膜组织就用来治疗中、重度颅脑损伤的婴幼儿的硬膜缺损，没有发生术后并发症，比如移植排斥。在近代，羊膜被用来进行眼表重建，如角化病、苯丙酮酸尿症、结膜Bowens病，以及其他影响角膜上皮的疾病。羊膜在预防角膜新生血管化、在治疗持久性角膜营养性溃疡方面也非常成功。羊膜还被用来治疗烧伤，结果表明，移植耐受性很好，成功帮助了受伤组织的治愈。
鉴于目前羊膜的安全性状况，可以至少开展Ⅰ期或者Ⅱ期临床研究探讨AECs的安全性和有效性，尽管如此，但是与免疫原性和其他因素有关的问题需要仔细评估。例如，这些细胞的传代是否需要异种滋养细胞或血清支持，还需要严密监视培养的AECs，因为干细胞在分化和传代过程中会上调MHC-Ⅰ，从而使AECs成为免疫清除的目标。
9.结论
临床前动物实验已经证明，AECs具有很强的抑制免疫应答的能力，有效的诱导免疫耐受，有效的逆转炎症造成的损伤等。也有证据证明AECs可以在体内分化成神经元细胞，帮助组织再生。更鼓舞人心的是，已经证明羊膜组织在临床上的使用是安全和有效的。如此这般，将AECs的应用从临床前阶段过渡到临床阶段的速度应该加快。然而，还是需要进一步的研究来阐明其发挥抗炎和再生潜能的机制。尽管如此，AECs有很多特性可使其应用于再生医学，更具体地说，应用于神经退行性疾病的治疗。（以下为原文）
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